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        植物組培培養基本操作步驟

          組織培養的步驟

          培養基配制

          配制培養基有兩種方法可以選擇,一是購買培養基中所有化學藥品,按照需要自己配制;二是購買商品的混合好的培養基基本成分粉劑,如MS、B5等。自己配制可以節約費用,但浪費時間、人力、且有時由于藥品的質量問題,給實驗帶來麻煩。目前國內的情況看,多數還是自己配制。

          1、配制幾種母液

          一般配制成100倍MS有機母液。配成1L母液,倒入1L試劑瓶中,存放于冰箱中。

          1.1配制MS大量元素母液

          1.2配制MS微量元素母液

          1.3配制MS有機母液

          1.4配制MS鐵鹽母液

          MS母液有5種大量元素母液,加上MS微量元素母液、MS有機母液和MS鐵鹽母液,共8種母液。

          2、激素母液的配制

          各種生長素和細胞分裂素要單獨配制,不能混合在一起,生長素類一般要先用少量95%的酒精或1當量的NaOH溶解,細胞分裂素一般要先用1當量的鹽酸溶解,然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。

          3、配制培養基

          以配置1L MS培養基為例,按順序進行如下操作:

          3.1先在燒杯中放入一些蒸餾水。

          3.2分別取上面八種母液10ml倒入。

          3.3一般稱取30g蔗糖倒入,攪拌溶解。

          3.4加蒸餾水用量筒定溶至1L。

          3.5按設計好的方案添加各種激素,由于激素的用量很小,而且激素對組培植物的生長至關重要。所以有條件的話好用微量可調移液器吸取,減少誤差。

          3.6用精密試紙或酸度計調整PH至5.7~5.8。(有條件的話使用酸度計,比較精確) 可配1當量的HCL和1當量的NaOH用來調溶液PH值。

          1當量HCL配制:用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

          1當量NaOH配制:稱取NaOH 4g 配成100ml溶液。

          3.7稱取5g左右瓊脂粉(質量好的瓊脂粉),倒入上面配好的溶液中,放在電爐上加熱至沸騰,直到瓊脂粉熔化。

          3.8稍微冷卻后,分裝入培養容器中。無蓋的培養容器要用封口膜或牛皮紙封口,用橡皮筋或繩子扎緊。

          3.9放入消毒滅菌鍋滅菌,滅菌20分鐘左右。

          3.10滅菌后從滅菌鍋中取出培養基,平放在實驗臺上令其冷卻凝固。

          滅菌

          滅菌是組織培養重要的工作之一。初學者要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是:凡是暴露在空氣中的物體,接觸自然水源的物體,至少它的表面都是有菌的。依此觀點,無菌室等未處理的地方、超凈臺的表面、簡單煮沸的培養基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內表,如整個消化道、呼吸道,即我們呼出的氣體、培養容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。

          這里所指的菌,包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。菌的特點是:極小,肉眼看不見。無處不在,無時不有,無孔不入。在自然條件下忍耐力強,生活條件要求簡單,繁殖力極強,條件適宜時便可大量滋生。

          無菌的范疇是:經高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體,經其他物理或化學的滅菌方法處理后的物體,高層大氣、巖石內部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內部,強酸強堿,化學元素滅菌劑等表面和內部都是無菌的。

          滅菌是指用物理或化學的方法,殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體,即把所有生命的物質全部殺死。與此相關的一個概念是消毒,它指殺死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再發生危害作用,顯然經過消毒,許多細菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不會完全殺死,即由于在消毒后的環境里和物品上還有活著的微生物,所以通過嚴格滅菌的操作空間(接種、超凈臺等)和使用的器皿,以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進行的操作,就叫做無菌操作。

          植物組織培養對無菌條件的要求是非常嚴格的,甚至超過微生物的培養要求,這是因為培養基含有豐富的營養,稍不小心就引起雜菌污染。要達到徹底滅菌的目的,必須根據不同的對象采取不同的切實有效的方法滅菌,才能保證培養時不受雜菌的影響,使試管苗能正常生長。

          常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類,即:物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施;化學方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法和藥劑要根據工作中的不同材料不同目的適當選用。

          1.培養基用濕熱滅菌

          培養基在制備后的24小時內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是:在密閉的蒸鍋內,其中的蒸汽不能外溢,壓力不斷上升,使水的沸點不斷提高,從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下,鍋內溫度達121℃。在此蒸汽溫度下,可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。

          注意完全排除鍋內空氣,使鍋內全部是水蒸氣,滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法,但目的都是要排凈空氣,使鍋內均勻升溫,保證滅菌徹底。常用方法是:關閉放氣閥,通電后,待壓力上升到0.05MPa時,打開放氣閥,放出空氣,待壓力表指針歸零后,再關閉放氣閥。關閥再通電后,壓力表上升達到0.1MPa時,開始計時,維持壓力0.1~0.15MPa,20分鐘。

          按容器大小不同,保壓時間有所不同。如果容器體積較大,但是放置的東西數量很少,也可以減少時間。
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